質粒DNA及mRNA疫苗下游工藝解決方案

2021-12-17 21:58:35

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mRNA藥物

圖1：mRNA新冠疫苗（來源：網絡）

mRNA這個技術起始于20世紀90年代，當時證明在小鼠中注入mRNA后可以產生該基因編碼的蛋白質，之后進展緩慢。直到進入21世紀隨著技術的發展mRNA藥物技術趨于成熟。mRNA疫苗是近年來新興的一種疫苗形式，其基本原理是通過特定的遞送系統將表達抗原靶標的mRNA導入體內，在體內表達出蛋白抗原并刺激機體產生特異性免疫學反應，從而使機體獲得免疫保護。

mRNA藥物開發面臨的挑戰

1.利用非病毒載體脂質體遞送技術解決mRNA成藥穩定性

2.人體免疫系統對mRNA藥物排斥問題

3.低溫（-20℃-70℃）儲存及運輸問題的解決

mRNA藥物的優勢

1.mRNA藥物制備，無需細胞培養或者動物源基質，生產過程比蛋白質簡單，所以成本更低。

2.mRNA屬于人體細胞內自有物質，可以自然降解無代謝毒性。

3.如果病毒變異，修改mRNA的結構比修改蛋白質結構容易很多。

4.mRNA疫苗最大優勢還是速度，這對于突發疫情顯然是一個巨大優勢。

mRNA新冠疫苗

代表企業：

蘇州艾博生物科技有限公司

斯微（上海）生物科技有限公司

上海藍鵲生物醫藥有限公司

珠海麗凡達生物技術有限公司

嘉晨西海（杭州）生物技術有限公司

深圳深信生物科技有限公司

太倉美諾恒康生物技術有限公司

深圳市瑞吉生物科技有限公

深圳厚存納米藥業有限公司

圖2：mRNA新冠疫苗1

新冠mRNA疫苗是將新冠病毒的刺突糖蛋白-S蛋白的mRNA或S蛋白的部分mRNA（如RBD蛋白）在體外進行相關的修飾后傳遞至機體細胞內表達并產生蛋白抗原，從而使機體產生針對該抗原的免疫應答，進而擴大機體的免疫能力2。

圖3：體外轉錄（IVT）mRNA生產和裝配過程3

mRNA新冠疫下游工藝解決方案

圖4：mRNA疫苗生產制備流程圖[4]

圖5：mRNA新冠疫苗下游工藝過程（自制）

質粒DNA規模化制備

圖6：質粒DNA的規模化制備（自制）

圖7：質粒DNA的規模化純化（自制）

質粒DNA規模純化，先用凝膠過濾層析Seplife 6FF粗純質粒，質粒分子尺寸大，其它物質（RNA,HCP,HCD)分子尺寸小，依據分子尺寸進行分離，分離得到的含質粒的組份在經Seplife? Plasmid LX親和層析進行中度純化，中度純化時親和介質吸附——洗脫質粒DNA，開環的DNA流穿，然后再用高剛性高分辨率陰離子交換介質Seplife large scale Q HP去除痕量的內毒素等雜質，這種工藝路線被廣泛用于質粒DNA的純化。

質粒DNA純化的雜質RNA也可以用4M CaCl2沉淀去除，Seplife? Plasmid LX親和層析可以去除開環的DNA，高分辨率陰離子交換介質去除痕量的內毒素及HCP等雜質被廣泛應用。同時也可以用疏水層析去除開環的DNA，具體選擇那種工藝路線還要結合實際情況綜合考慮。

DNA線性化及體外mRNA制備

純化后的質粒DNA經過超濾濃縮及換液后，用限制性內切酶線性化質粒DNA，線性化后目標DNA分子尺寸小，質粒結構DNA分子尺寸大，可用超濾的方式純化目標DNA并換液，然后用轉錄酶將DNA轉錄為mRNA。

mRNA的純化

圖8:mRNA疫苗的純化（自制）

制備的mRNA用Oligo dT填料親和層析純化，Oligo dT與mRNA的PolyA尾巴可以發生特異性結合，經過親和層析純化的mRNA使用加帽酶通過與真核翻譯起始因子4E（EIF4E）結合來穩定mRNA并增加蛋白翻譯5。加帽后mRNA再次用Oligo dT親和層析純化，后經高分辨率陰離子交換層析Seplife large scale Q HP精細純化去除加帽過程種引入的痕量雜質。這整個過程種要注意每個單元之間緩沖液的協調，根據實際情況進行緩沖液置換。加帽后的mRNA除菌過濾后，在脂質體包被及制劑化即完成了mRNA疫苗的制備。

質粒DNA純化相關介質

Seplife 6FF

Seplife? Plasmid LX

LXMS-30Q

Phenyl Seplife 6FF

Seplife? Suncore 700

mRNA純化相關介質

Oligo dT親和介質（開發中）

Seplife large scale Q HP

緩沖液置換相關介質

Seplife G-25 Medium

參考資料

https://www.sciencemag.org/news/2020/12/coronavirus-may-sometimes-slip-its-genetic-material-human-chromosomes-what-does-mean

Kramps T., Elbers K. (2017)Introduction to RNA Vaccines. In: Kramps T., Elbers K. (eds) RNA Vaccines.Methods in Molecular Biology, vol 1499. Humana Press, New York, NY.

Sergio Linares-Fernández,Céline Lacroix, ,Tailoring mRNA Vaccine to Balance Innate/Adaptive ImmuneResponse,Trends in Molecular Medicine,Volume 26, Issue 3,2020,Pages 311-323.

Maruggi G , Zhang C , Li J , etal. mRNA as a Transformative Technology for Vaccine Development to ControlInfectious Diseases[J]. Molecular Therapy, 2019.

Pardi N , Hogan M J , Porter FW , et al. mRNA vaccines — a new era in vaccinology[J]. Nature Reviews DrugDiscovery, 2018.

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