概述

建立蛋白質(zhì)層析純化工藝時，最重要的是需要考慮純化得到的蛋白質(zhì)應(yīng)能滿足其后續(xù)應(yīng)用要求。蛋白質(zhì)的數(shù)量及純度都必須滿足實驗分析要求。而且，因為后續(xù)研究需要的是保持良好折疊結(jié)構(gòu)的活性蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)行為的相關(guān)信息也需要考慮。在純化及后續(xù)的保存過程中，很多處理方法都會對蛋白質(zhì)的性質(zhì)產(chǎn)生影響，如蛋白質(zhì)的去折疊、聚集、降解和失活等。制定詳細計劃，在最短時間內(nèi)完成蛋白質(zhì)純化，并在最穩(wěn)定的條件下進行保存才算是成功地完成了其整個純化過程。

當我們純化蛋白時，最重要的就是要保持蛋白在純化過程中不能去折疊、聚集、降解和失活，或者是盡量降低純化過程對蛋白活性帶來的損失。這就要求蛋白在整個純化過程中要始終保持可溶性和活性。

在層析工藝緩沖液選擇時應(yīng)考慮以下幾個因素：pH值、緩沖體系、添加劑。其中每一個因素都要根據(jù)你的目的蛋白進行優(yōu)化，并以目的蛋白的活性作為優(yōu)化的評估標準。

pH的選擇

在蛋白質(zhì)層析工藝中，首先我們要考慮蛋白質(zhì)的pH穩(wěn)定性和可溶性，一般蛋白質(zhì)在其pI附近的pH值溶液中容易沉淀。在層析工藝開發(fā)前，我們先要驗證目標蛋白的pH穩(wěn)定性。每一種層析介質(zhì)都有它的工作pH范圍，我們在開發(fā)層析工藝時，要了解所選擇的層析介質(zhì)的工作pH范圍。所以我們設(shè)計層析工藝時，同時要考慮蛋白質(zhì)的pH穩(wěn)定性范圍及層析介質(zhì)的工作pH范圍。

緩沖液體系的選擇

每一步純化過程中，蛋白質(zhì)的溶液環(huán)境對其穩(wěn)定性和活性的保持都非常關(guān)鍵。蛋白質(zhì)應(yīng)該保存在一個良好的緩沖液環(huán)境中，要避免突然的pH值變化，以其防止對蛋白質(zhì)折疊狀態(tài)、溶解性和活性造成不可逆的影響。

圖 1. 含Tris堿及其酸式物的Tris緩沖液溶液。Tris 25°C的pKa值是8.06，表示當pH=8.06，50%的Tris是質(zhì)子化（酸式結(jié)構(gòu)），50%是去質(zhì)子化（堿式結(jié)構(gòu)）。

緩沖液是一種含有共軛酸/堿對的水溶液。緩沖液的pH值范圍根據(jù)其pKa值決定。該pKa值定義為50%的分子為酸式結(jié)構(gòu)，50%為堿式結(jié)構(gòu)時的pH值 （圖1）。關(guān)于緩沖液的一個常規(guī)原則是，其pH值應(yīng)保證在pKa值左右1個pH值單位范圍內(nèi)，從而保證其具有良好的緩沖能力。如此可以保證同時有足夠的以酸式結(jié)構(gòu)和堿式結(jié)構(gòu)存在的分子在加入 H+ 或者 OH- 時可以將它們中和。這樣，緩沖液就可以防止pH變化導致的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性改變。

一種好的緩沖液必須具有以下特征  :

?水溶性

?化學穩(wěn)定性

?在所需pH范圍內(nèi)良好的緩沖能力

?與分析和實驗應(yīng)用條件具有良好的兼容性

?與其他溶質(zhì)具有良好的兼容性

很多物質(zhì)都可以用于生物緩沖液。最常使用的緩沖液成分通常具有接近中性的pKa值，可在生理pH值范圍左右使用。表1列出了4種最常用的生物緩沖液、各自的pH值應(yīng)用范圍及各自可能對蛋白質(zhì)純化過程產(chǎn)生影響的優(yōu)缺點。為保證足夠的緩沖能力，這些緩沖液的濃度通常為25mM。

表一：蛋白質(zhì)純化中最常用的生物緩沖液。緩沖液在一定pH值范圍內(nèi)可保持它們的緩沖能力，部分緩沖液成分會對某些層析過程或者分析實驗造成影響。

添加劑的選擇

除了一個合適的緩沖液體系，蛋白質(zhì)純化過程中——從溶菌到保存——所使用的溶液通常還含有很多其他對蛋白質(zhì)純度、穩(wěn)定性和活性方面均具有一定作用的成分。溶菌緩沖液和純化工藝的前期步驟中常常會添加蛋白酶抑制劑以防止目標蛋白質(zhì)被內(nèi)源性蛋白酶酶解。而純化工藝的后期一般不用再添加這些蛋白酶抑制劑，因為此時幾乎所有的蛋白酶都已經(jīng)從目標蛋白質(zhì)分離出去。蛋白質(zhì)的保存緩沖液中通常要添加金屬螯合劑，如EDTA或EGTA。這些金屬螯合劑與 Mg2+結(jié)合以防止目標蛋白質(zhì)被所含的金屬蛋白酶分解。還有一些其他的添加劑，主要是用來保護蛋白質(zhì)不被破壞和增強其溶解性。

表二：蛋白質(zhì)純化中用于增強蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的常用添加劑。

添加劑只在必要時才使用?？赡苄枰啻螄L試才能確定某些添加劑是否對一些特定蛋白質(zhì)的純化工藝有效。

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