mAb純化工藝過程中常見問題及解決方案
單克隆抗體制備過程中，細胞培養的上清液經過深層過濾等方式進行澄清，澄清后用rProtein A Seplife Suno捕獲及初步純化，初步純化在經低pH（pH3.4-3.8）滅活病毒，對于在低pH環境中不穩定的mAb可采用S/D的方式滅活病毒，滅活病毒后用陽離子交換 SP Large Scale 吸附洗脫模式繼續純化，進一步去除HCP及親和層析過程中可能脫落的 Protein A 親和配體，同時陽離子交換層析過程通過改變pH的方式洗脫也是去除電荷異構體的主要方式，陽離子交換層析后用陰離子交換層析Q Large Scale進一步精細純化去除痕量的病毒及HCP等雜質，聚集體及片段的去除也多在離子交換層析階段去除。經基于Protein A親和層析平臺技術的三步層析后，在通過UF/DF的方式置換緩沖液，納濾除病毒等即可制劑化。
mAb純化過程中常見問題
Protein A親和洗脫過程中產生沉淀:
高載量的Protein A親和層析填料結合mAb的過程中，在填料表面高密度聚集，疏水性強的mAb分子容易高密度聚集沉淀，這個時候可以嘗試在洗脫液中添加一些蛋白增溶劑，防止高密度聚體引起的沉淀，如 200mM-500mM 的 Arg 或 1M尿素等。另一方面在低pH洗脫過程中，mAb分子在低pH環境中不穩定時也容易形成沉淀，這時可用較高的pH如pH4.0在加一定量如500mM Arg進行弱洗脫，同時洗脫下來要立馬用 1M Tris等緩沖液中和pH。
Protein A親和層析洗脫液中HCP殘留過高：
關注藍曉生命科學公眾號，關注后，在搜索處搜索HCP，查看《抗體純化中Protein A親和層析階段HCP去除策略》推文。另一種方式是親和層析后在進行一步深層過濾，這時選擇的深層過濾膜組件可選擇帶陰離子交換作用的膜組件。
Protein A親和層析洗脫液中聚集體含量偏高：
由于mAb分子在Protein A親和層析填料中高密度產生聚集體，這時可通過降低mAb的結合量一方面減少保留時間另一方面降低上樣量，同時也可通過在結合緩沖液中增加一些蛋白增溶劑如尿素，鹽等物質減弱mAb分子之間的作用，而減少洗脫液中的聚集體含量。
低pH病毒滅活過程中活性損失大：
在一些mAb分子低pH病毒滅活過程中，由于其AA組成，等電點，穩定性等因素可能導致mAb分子降解及聚集等而影響mAb的活性收率，這時就要考慮其它病毒滅活方式，如S/D。S即solvent，指有機溶劑，D即detergent，指去垢劑，S/D病毒滅活法即指采用有機溶劑和/或去垢劑對產品中可能存在的病毒顆粒進行滅活，使其失去感染活性的一種病毒滅活方法。S/D病毒滅活時，最主要使用的有機溶劑為TNBP；最主要使用的非離子型去污劑為Triton X-100、Tween 80，其中Triton X-100去垢劑能力更強。病毒滅活時，TNBP可單獨使用，也可以與去垢劑中的任意一種聯合使用。S/D病毒滅活時，TNBP常用濃度0.1%-0.5%，Triton X-100濃度常用1%。
離子交換層析后電荷異構體含量高：
關注藍曉生命科學公眾號，關注后，在搜索處搜索電荷異構體，查看《單克隆抗體電荷異構體去除策略》推文。
離子交換層析精純后聚集體及片段含量高：
關注藍曉生命科學公眾號，關注后，在搜索處搜索聚集體，查看《抗體藥制備工藝中聚集體及片段的去除解決方案》推文。
精純后一些糖基化分子的去除：
關注藍曉生命科學公眾號，關注后，在搜索處搜索糖基化，查看《糖基化蛋白的分離純化》推文。
小結：此文總結是藍曉科技應用開發部，在純化抗體中多個項目工藝過程的總結，在不同的mAb分子純化過程中會有所差異，僅供參考，更多mAb純化過程中常見問題及解決方案，請留言補充。
mAb下游純化案例
基于Protein A親和平臺技術三步層析法純化mAb:
樣品：某mAb原液經深層過濾后的上清液
圖1：rProtein A Seplife Suno純化mAb色譜曲線
圖2：SP Large Scale精細純化mAb色譜曲線
圖3:Q Large Scale精細純化mAb色譜曲線
圖4：三步層析后HPLC-SEC檢測圖
純化結果：mAb三步層析法純化后SEC純度99.15%；總收率 84.50%；HCP殘留5 ppm，如表1.
表1：藍曉科技三步層析法純化mAb結果
rProtein A Seplife Suno:
是藍曉科技應對抗體客戶需求推出的Protein A親和層析填料，以球形，高交聯瓊脂糖凝膠為基質，通過自主創新技術將耐堿性重組蛋白A鍵合到該基質上。可以特異性地與抗體的Fc區結合，用于抗體（單抗和多抗）的分離純化，只需一步親和層析，即可從腹水、血清或培養液等樣品中得到高純度的抗體。在mAb純化中用于捕獲及初步純化，mAb載量高達80mg/ml。
藍曉科技自主開發擁有專利的rProtein A系列蛋白A親和填料于2022年7月14日通過美國FDA DMF備案（MF#：037326），成為國內為數不多的通過FDA DMF備案的國產填料供應商。這意味著使用藍曉科技相關產品的客戶，在向FDA提交進行新藥注冊的監管備案文件中可直接引用DMF備案資料，而無需再提供有關原料和輔料的具體信息。
rProtein A Seplife Accel 50
藍曉科技為了滿足單克隆抗體（mAb)，雙特異性抗體（bsAb)，多特異性抗體，抗體偶聯藥（ADC)等各種抗體藥大規模生產需求設計開發的以聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA)為基質，偶聯高耐堿性重組Protein A 配基親和層析介質。該產品結合了藍曉科技專有噴射法單分散微球制備、精準造孔、表面修飾（長鏈間隔臂親水改性），配基偶聯等技術使得產品具有高剛性、低反壓、高動態載量、媲美軟膠的生物相溶性，聚體去除效率高等優點，與公司瓊脂糖基質Protein A親和介質形成完整的產品組合，可有效滿足不同客戶多元化的應用場景。
SP/Q Large Scale
用于mAb純化過程中精細純化，去除親和層析過程中可能脫落的Protein A及HCP，電荷異構體，聚集體及片段。此系列填料為高剛性瓊脂糖微球填料，耐壓可達0.5MPa,廣泛用于生物分子的分離純化。
Seplife LXPM Q/SP 5504M/S
聚合物離子交換層析填料，其耐壓可達0.8MPa，用于mAb中度及精細純化。
MMC/MA Large Scale
以離子交換為主同時兼具一定的疏水作用力的多模式層析填料，pH伴隨鹽雙梯度洗脫模式廣泛用于mAb純化過程中聚集體及片段的去除。
Seplife S-200
用于mAb純化過程中精純階段殘留的聚集體及片段的去除。
Boricacid Seplife 4FF及硬膠Boricacid Seplife LXPM 5504
