Vero細胞

Vero胞(非洲綠猴腎細胞)是日本學者Yasumura和Kawakita兩人在1962年正式從非洲綠猴腎臟分離的，初次用于生產人用生物制品的異倍體貼附依賴性細胞，并建立了細胞系和不同代次的細胞庫。在此之前，對生物制品的研究和生產只允許用原代細胞或二倍體細胞。

近年來隨著生物技術的發展，動物細胞培養技術已從簡單的試驗研究拓展到了生物學研究和商業應用領域。生物制品如病毒性疫苗、醫學治療性抗體的研究與生產都用到了細胞培養技術。

Vero細胞在病毒類生物制品生產上的應用

?新冠病毒滅活疫苗

?狂犬病毒滅活疫苗

?輪狀病毒疫苗

?流行性乙型腦炎病毒疫苗

?腸道病毒 71 型疫苗

?脊髓灰質炎滅活疫苗(IPV)

?口服脊髓灰質炎病毒疫苗(OPV)

1987年，WHO才正式批準傳代細胞系作為生物制品生產的基質。Vero細胞被批準用于人用疫苗的生產后，開始生產的人用疫苗是Barrett等生產的脊髓灰質炎滅活疫苗(IPV)，之后Vero細胞用于狂犬病毒疫苗和口服脊髓灰質炎病毒疫苗(OPV)等多種人用疫苗生產。Vero細胞在病毒性疫苗生產的應用已有30年之久，尤其是狂犬病毒疫苗和脊髓灰質炎疫苗。

Vero細胞的優勢

?容易建立細胞庫和保存，可連續傳代，生長速度快；

?Vero 細胞遺傳性狀穩定，惡性化概率小，無外源性污染，具有良好的生物安全特性；

?Vero 細胞對多種病毒敏感，生產的病毒滴度高；

?Vero 細胞對培養條件要求不高，在微載體表面能良好的貼附生長，易在生物反應器放大培養。

大規模反應器微載體培養Vero細胞

馴化Vero細胞適應在用于大規模生產的無血清培養基內生長。帶有詳細傳代記錄的Vero細胞凍存管被復蘇；并傳代到T形瓶和滾瓶中，生產出足夠數量的細胞以接種Seplife LX-MC-dex1微載體生物反應器。細胞匯合后， 細胞按照大約1:7的比例傳代到后面的生物反 應器。最終的細胞密度在2-3×106/ml。

微載體培養是目前公認的最有發展前途的一種動物細胞大規模培養技術，其兼具懸浮培養和貼壁培養的優點，放大容易。將對細胞無害的微載體顆粒加入培養容器的培養液中，作為載體，使細胞在微載體表面附著生長，同時通過持續攪動使微載體始終保持懸浮狀態。貼壁依賴性細胞在微載體表面上的增殖，要經歷黏附貼壁、生長和擴增三個階段。細胞只有貼附在固體基質表面才能增殖，因此細胞在微載體表面的貼附是進一步鋪展和生長的關鍵。細胞主要通過靜電引力和范德華力與微載體黏附，這取決于細胞與微載體的接觸概率和相融性。

圖片來源：科興中維生物反應器微載體培養的vero細胞顯微鏡下觀察的照片_百度圖片搜索 (baidu.com)

藍曉科技的微載體廣泛應用在疫苗、單抗、基因治療病毒載體等生物制品的大規模生產中，藍曉科技自主研發的Seplife LX-MC-dex1細胞培養微載體在Vero細胞、CHO細胞、293T細胞及MDCK細胞等已廣泛用于生物制品的大規模生產中，細胞可貼附微球 2D 表面生長，1g的Seplife LX-MC-dex1微載體提供 4400 cm2的表面積給細胞貼附。

Seplife LX-MC-dex1技術參數

細胞生長曲線

Vero細胞在兩家不同批次微載體的培養基中，24h至96h細胞生長曲線如圖1所示。

圖1：藍曉科技細胞培養微載體和進口微載體用于Vero細胞培養生長曲線

細胞生長情況觀察

圖2：藍曉科技細胞培養微載體用于Vero細胞培養細胞生長情況觀察

Seplife LX-MC-dex1微載體的應用領域非常廣泛，基于微載體生產的疫苗除了新冠以外，還包括脊髓灰質炎、風疹、狂犬病、流感、日本腦炎（乙型腦炎）、呼吸道合胞病毒（RSV）和口蹄疫（FMD）疫苗等。與其他細胞培養工藝相比，微載體培養工藝可以提高產量，降低成本，并減少污染。

Seplife LX-MC-dex1微載體使用方法

1.微載體預處理

首先，干燥的微載體在無 Ca2+ 和 Mg2+ 的磷酸緩沖液（PBS pH=7.4，每克微載體加50-100ml）中在室溫下浸泡膨脹至少 3 小時。然后，棄去上清液，用新配制的無 Ca2+ 、Mg2+ 的PBS（pH=7.4，每克微載體加30-50ml）洗滌微載體數分鐘。接著，棄去 PBS，換上新的無 Ca2+ 、Mg2+ 的 PBS（pH=7.4，每克微載體加 30-50ml）。之后，微載體溶液用高壓滅菌法滅菌（115℃，15min，15psi）。微載體Seplife LX-MC-dex1 非常穩定，可以反復（至少5次）長時間 （130°C，12h，27psi）進行高壓滅菌而不影響其性能。滅菌結束后使用前，加入培養基潤洗置換（20-50ml/g），之后加入 10%血清或無血清培養基放置過夜。

2.微載體培養 

準備好消化好的細胞，連同之前準備好的微載體一起加入方瓶或反應器中（微載體加量 1-5g/L），在一定條件下開始培養，4 小時后觀察細胞貼附情況。如果細胞貼附良好，繼續跟蹤培養，觀察細胞生長情況。

3 微載體培養操作要點 

（1）培養初期：

保證培養基與微球體處于穩定的 pH 與溫度水平，接種細胞（對數生長期， 而非穩定期）至終體積 1/3 的培養液中，以增加細胞與微載體接觸的機會。常使用 2-3g/L 的微載體含量，更高的微載體濃度需要控制環境或經常換液。由于動物細胞無細胞壁，對剪切力敏感，因而無法靠提高攪拌轉速來增加接觸概率。通常的操作方式是：在貼壁期采用低攪拌轉速，時攪時停；數小時后，待細胞附著于微載體表面時， 維持設定的低轉速，進入培養階段。微載體培養的攪拌非常慢，最大速度 75r/min。 

（2）貼壁階段（3-8d）后，緩慢加入培養液至工作體積，并且增加攪拌速度保證完全均質 混合。 

（3）培養維持期：進行細胞計數（胞核計數）、葡萄糖測定及細胞形態鏡檢。隨著細胞增 殖，微球變得越來越重，需增加攪拌速率。經過 3d 左右，培養液開始呈酸性，需換液。具體方 法：停止攪拌，讓微珠沉淀 5min，棄掉適宜體積的培養液，緩慢加入新鮮培養液（37℃），重 新開始攪拌。

（4）收獲細胞：首先，排干培養液，至少用緩沖液漂洗 1 遍；然后，加入相應的酶，快速 攪拌（75-125r/min）20-30min；最后，解離收集細胞及其產品。 

（5）微載體培養的放大：可以通過增加微載體的含量或培養體積進行放大。使用異倍體或 原代細胞培養生產疫苗、干擾素，已被放大至 4000L 以上。

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