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發(fā)布時間：2022-12-24 01:56:40
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問:His標(biāo)簽蛋白鎳柱純化有雜帶怎么辦？1.樣品本身的的屬性，His蛋白容易被體系中的蛋白酶降解時，此時就要在樣品中加入蛋白酶抑制劑。避免在純化過程中His蛋白被降解，呈現(xiàn)出蛋白純化后純度下降。
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開始純化蛋白前應(yīng)先制備初始樣品。真正進(jìn)行蛋白純化的操作之前，首要考慮是目的蛋白的來源。樣品來源可為原始樣品，例如肝臟，肌肉或腦組織。當(dāng)前，更為常見的是從重組來源的樣品純化蛋白質(zhì)。一些重要決定需要提前考慮以便優(yōu)化后續(xù)的純化。研究者需要考慮蛋白質(zhì)的最終用途（例如治療性生物藥，酶測定，結(jié)構(gòu)研究，抗體生成），因?yàn)檫@將決定最終蛋白質(zhì)制備所需的量和純度。盡管蛋白質(zhì)表達(dá)的詳細(xì)討論超出本文范圍，但是在這一點(diǎn)上仍有幾個值得考慮的基本點(diǎn)，因?yàn)樗鼈冎苯佑绊懞罄m(xù)的蛋白純化。
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紅色染料親和層析介質(zhì)：紅色染料親和介質(zhì)是將活性紅120共價結(jié)合到高流速瓊脂糖凝膠微球上的一種親和層析介質(zhì)，活性紅120是一個多環(huán)染料，與自然產(chǎn)生的NADP+具有某些結(jié)構(gòu)的相似性，可以強(qiáng)烈并且特異性結(jié)合寬范圍的蛋白質(zhì)，如乳酸脫氫酶。能與紅色染料特異性結(jié)合的蛋白是由于它們需要核苷酸輔助因子。其他一些蛋白，例如白蛋白，脂蛋白，凝血因子和干擾素，是以非特異性方式與紅色染料相結(jié)合的，如芳香環(huán)陰離子配基的靜電力相互作用或者疏水鍵的相互作用。
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組氨酸（His）的殘基上帶有一個咪唑基團(tuán)，可以和Ni2+,Co2+等過渡金屬離子形成配位鍵而選擇性的結(jié)合在金屬離子上，這些金屬離子能夠用螯合配體固定在層析介質(zhì)上，因此帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋白在經(jīng)過裝配了金屬離子的層析介質(zhì)時可以選擇性的結(jié)合在介質(zhì)上，而其他的雜質(zhì)蛋白則不能結(jié)合或者僅能微弱結(jié)合。結(jié)合在介質(zhì)上的HIS標(biāo)簽蛋白可以通過提高緩沖液中的咪唑濃度進(jìn)行競爭性洗脫，從而得到較高純度的HIS標(biāo)簽蛋白。
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高流速瓊脂糖疏水層析介質(zhì)是將不同性質(zhì)的疏水基團(tuán)偶聯(lián)到高流速瓊脂糖凝膠過濾層析介質(zhì)上形成的疏水性層析分離介質(zhì)，利用生物分子表面的疏水基團(tuán)與層析介質(zhì)上的疏水基團(tuán)相互作用強(qiáng)弱不同進(jìn)行分離。一般而言，離子強(qiáng)度（鹽濃度）越高，物質(zhì)所形成的疏水鍵越強(qiáng)。影響疏水作用的因素包括：鹽濃度，溫度，pH，表面活化劑和有機(jī)溶劑。高流速瓊脂糖疏水層析介質(zhì)廣泛應(yīng)用于生物大分子的純化分離。
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GST標(biāo)簽蛋白純化親和層析介質(zhì)：谷胱甘肽配基是通過12個原子連接臂偶聯(lián)到4%的高流速瓊脂糖層析介質(zhì)上，這種偶聯(lián)使得介質(zhì)對GST-tag融合蛋白和其他谷胱甘肽結(jié)合蛋白有更強(qiáng)的結(jié)合能力，介質(zhì)的高蛋白載量和良好的流速性能使大規(guī)模生產(chǎn)簡單直接。